中国药典中药材DNA条形码标准序列

《中国药典中药材DNA条形码标准序列》是中药材DNA条形码分子鉴定研究与实践的学术专著，全面展示了该领域的最新成果，分为总论、各论和附录三部分。总论主要介绍中药材DNA条形码分子鉴定体系及标准操作流程和研究实例。各论以《中华人民共和国药典》（2010版，2015版）收载药材为对象，提供了中药材的DNA条形码标准序列。依照中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则，对药材样本、基原物种样本、复核样本和对照药材进行研究，获取其DNA条形码标准序列，并详细介绍各药材DNA提取及序列扩增等实验操作流程，既注重学术性亦体现实用性，具有很高的学术和实用参考价值。附录收录了提取物、分泌物和树脂等类药材基原物种以及相关药材和混伪品DNA条形码序列特征等。

陈士林，现任中国医学科学院药用植物研究所所长、博士生导师；世界卫生组织（WHO）传统医学合作中心主任；国家药典委员会委员；曾在英国皇家植物园Kew接受专业培训；担任香港理工大学访问教授等。现兼任教育部“中药资源研究工程中心”主任；中国野生植物保护协会野生药用植物保育委员会主席、中国农业技术推广协会中药材专业委员会主任等。

享受国务院政府特殊津贴奖励，担任《中草药》、《Chinese Mediclnes》 《中国中药杂志》、《Journal of Chinese Pharmaceutical Science》、《世界科学技术》、《中国现代中药》、《中药材》等国内国际十余种杂志编委或副主编；获得5项国家及省部级科技成果奖，“道地药材三维鉴定及产地适宜性研究”获的国家科技进步2等奖；主编《中药资源可持续利用导论》等4部书籍，国内外杂志发表研究论文150余篇。多次到美国、英国、意大利、秘鲁、巴基斯坦等国交流学习。

序
前言
编写说明
上篇 总论
第一章 绪论
第一节 中药鉴定学发展历程
第二节 中药材DNA条形码分子鉴定技术及其发展历程
一、DNA条形码技术发展简史
二、中药材DNA条形码分子鉴定体系的形成
第二章 中药材DNA条形码分子鉴定体系
第一节 中药材DNA条形码数据库和鉴定系统
一、数据库构成
二、数据库序列核验
三、物种鉴定操作方法
四、中药材DNA条形码二维码及其使用
第二节 中药材DNA条形码分子鉴定技术流程
一、样品的收集及DNA提取
二、PCR扩增及DNA条形码的获取
三、结果判定
第三节 中药材DNA条形码未来发展方向
一、基于叶绿体基因组水平的中药材DNA条形码鉴定
二、下一代测序技术在中药材DNA条形码鉴定的应用
三、中药材DNA条形码鉴定技术的其他问题
第三章 中药材DNA条形码分子鉴定标准操作流程与研究实例
第一节 根、根茎、茎木和皮类药材DNA条形码分子鉴定标准操作流程
一、DNA提取操作步骤
二、PCR扩增
三、研究实例
第二节 叶、花、全草类药材DNA条形码分子鉴定标准操作流程
一、DNA条形码分子鉴定标准操作流程
二、研究实例
第三节 果实、种子类药材DNA条形码分子鉴定标准操作流程
一、DNA条形码分子鉴定标准操作流程
二、研究实例
第四节 真菌类药材DNA条形码分子鉴定标准操作流程
一、DNA条形码分子鉴定标准操作流程
二、研究实例
第五节 动物药材DNA条形码分子鉴定标准操作流程
一、DNA条形码分子鉴定标准操作流程
二、研究实例
参考文献
下篇 各论
一画
1 一枝黄花
二画
丁八人九刀
2 丁公藤
3 丁香
4 八角茴香
5 人参
6 人参叶
7 九里香
8 九香虫
9 刀豆
三画
三干土大山千川广女小飞马
10 三七
11 三白草
12 三棱
13 三颗针
14 干姜
15 土木香
16 土贝母
17 土荆皮
18 土茯苓
19 土鳖虫
20 大叶紫珠
21 大血藤
22 大豆黄卷
23 大皂角
24 大青叶
25 大枣
26 大黄
27 大蒜
28 大蓟
29 大腹皮
30 山麦冬
31 山豆根
32 山茱萸
33 山药
34 山柰
35 山香圆叶
……
参考文献
附录
拉丁名索引

《中国药典中药材DNA条形码标准序列》：
第一章 绪论
第一节 中药鉴定学发展历程
中药鉴定学是研究和鉴定中药的品种和质量、制定中药质量标准、寻找和扩大新药源的应用学科。中药的真伪、优劣对临床用药疗效与安全具有非常重要的作用，因此中药鉴定学是其他中医药学科发展的基础和保障，是中药领域的基础学科 （陈科力等， 2014）。人们在古代用眼、耳、舌等器官来识别自然界中的植物、动物和矿物的形、色、气、味，积累形成了早期的中药鉴别知识。《诗经》是我国现存最早有药物记载的书籍，包括来源和性状鉴别方法，是中药鉴定学的萌芽，如“蜉蝣之羽，衣裳楚楚” （蜉蝣的翅薄而透明 ）和“常棣之华，鄂不韡韡” （鲜艳的郁李花，萼蒂分明相连 ）。现存最早有完备记载的药学专著《神农本草经》载有比较完整的中药经验鉴别方法，所收载的 365种药物有 88种含鉴别描述。从秦汉时期到清代，中药鉴定的特点是以经验鉴别为主，对中药鉴定贡献较大的著作近 30部 （张贵君，1991） ，为中药鉴定学的形成和发展期。
中药鉴定学在古代本草学和现代生药学的基础上形成并发展起来。 1815年德国人 C. A. Seydler发表“Analecta Pharmacognostica”以后，其他学者相继出版了以讨论植物和动物药物为主的著作，称 “Pharmacognosie”，后传入日本译为“生药学”。日本本草鉴定大多引用和研究我国历代本草，明治维新以后发展为现代的“生药学”。 20世纪 30年代，国外生药学传入我国，中药鉴定受到国外科技和学术思想的影响，逐步形成中药鉴定学科。 1934年赵燏黄与徐伯鋆合编了《现代本草学——生药学》上册， 1937年叶三多广集西欧及日本书籍有关资料编写了《生药学》下册，把近代生药学理论和研究方法引入到中药研究，使中药鉴定的理论条理化，成为中药鉴定学的雏形著作。 1949年以后，我国生药鉴定学进入快速发展时期。楼之岑和徐国钧是我国现代生药鉴定的主要奠基者，以他们为代表的一批专家学者出版了一系列以中药鉴定为主要内容的学术著作，对现代生药鉴定方法进行了系统介绍，把四大鉴定方法 （基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定 ）引入中药鉴定，并广泛应用于实践研究，为中药鉴定学科的建设做出了开拓性贡献。 1977年成都中医学院主编了我国第一本高等院校《中药鉴定学》教材，是中药鉴定学史上的一个重要里程碑，标志着中药鉴定学科的形成。
中药因其种类繁多，来源复杂，形成了多种鉴定方法，常用的方法包括基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。基原鉴定是依据植 （动 ）物的分类学特征，对中药的来源进行鉴定研究；性状鉴定是通过眼观、手摸、鼻闻、口尝、水试、火试等方法来进行鉴定；显微鉴定是利用显微镜对药材的组织结构或粉末的显微特征进行观察、对中药真伪进行鉴定；理化鉴定是利用物理和化学的方法鉴定中药的真实性、纯度和品质优劣程度。在中药鉴定学的发展过程中，植物系统分类学、植物化学、生物化学、分子生物学、细胞生物学及现代仪器分析等多学科的相互融合并应用于中药的品质和资源研究，衍生和发展了中药资源学、中药分子鉴定学、中药 （材 ）商品学、中成药分析、药用植物学、药用动物学等学科，形成了中药鉴定学蓬勃发展的学科群。 21世纪初，现代生物技术、现代仪器分析技术和计算机技术开始大量应用于中药鉴定研究，中药分子鉴定学逐步形成。中药分子鉴定是应用 DNA分子标记技术鉴定中药原植 （动 ）物及其药材和饮片的方法。与经典的中药鉴定方法相比， DNA分子标记技术具有特异性强、微量、便捷、准确等特点。常用的 DNA分子标记技术包括 RFLP、RAPD、SSR、ISSR和 AFLP等。
DNA条形码分子鉴定是利用基因组中一段公认的、相对较短的 DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，由加拿大分类学家 Paul Hebert 于 2003年首次提出 （Hebert et al.，2003a），是 DNA分子鉴定技术基础上的最新发展。该方法通过筛选通用条形码，建立条形码数据库和鉴定平台，运用生物信息学方法分析比对 DNA数据，进而对物种进行鉴定。 DNA条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的束缚，鉴定快速准确，有望实现自动鉴定，是传统生物鉴定方法的有效补充和重大突破，因而受到了国内外学者的广泛关注，目前已成为物种鉴定和分类的研究热点 （Schindel & Miller，2005；陈士林等， 2007）。与其他分子鉴定方法相比， DNA条形码鉴定具结果客观和重复性良好、方法通用性强可构建统一数据库和鉴定平台、易于推广和标准化的特点 （陈士林等， 2012）。陈士林等在大量实验研究基础上建立了中草药 DNA条形码生物鉴定技术体系，包括以 ITS2为核心、 psbA-trnH为辅的植物类药材 DNA条形码鉴定体系和以 COI为主、 ITS2为辅的动物类药材 DNA条形码鉴定体系，为中草药准确、可靠鉴定及临床用药安全提供了新的手段。中药材 DNA条形码分子鉴定法指导原则已列入《中华人民共和国药典》 （2010年版第三增补本 ）。DNA条形码技术已经在中药基原植 （动 ）物和药材鉴定等方面得到了广泛推广应用。《科技日报》评论“中草药 DNA条形码鉴定体系的建立标志着中药鉴定学迈入通用和标准化的基因鉴定时代” （杨朝晖， 2014），国际期刊《 Biotechnology Advances》题为“草药鉴定从形态到 DNA的文艺复兴”的论文系统介绍了中草药 DNA条形码鉴定体系和鉴定数据库，该数据库收载了包括中国、日本、韩国、美国、欧洲和印度药典几乎所有药材的 DNA条形码序列。该体系可以实现对中药材及其基原植物、中药材种子种苗、粉末以及细胞、组织等来源材料的物种准确鉴定。多家中药企业定制了中药材 DNA条形码鉴定系统，为保障中药材安全应用提供有力工具，促进了中药鉴定方法体系的创新以及中药鉴定方法的标准化、数字化和国际化 （Chen et al.，2014）。中草药 DNA条形码技术在鉴定领域被公认为中药材从主观的眼观口尝到客观的基因判定的技术革命，它改变了生药鉴定学科被动追赶其他学科的局面，在鉴定学领域已处于国际学科前沿领先水平。中药 DNA条形码技术为解决中草药混用和掺假等行业问题提供了强有力工具，对保障传统草药临床用药安全具有重大现实意义。
第二节中药材 DNA条形码分子鉴定技术及其发展历程
由于中药材传统鉴定方法 （基原、性状、显微、理化鉴定 ）在物种鉴定上具有一定局限性，加之历代本草记载差异和不同地区用药习惯等原因，部分中药材同名异物、同物异名现象普遍存在，代用品、习用品、混伪品较多，中药材品种复杂混乱，给中药临床用药安全带来极大挑战，如： 2000年的马兜铃酸肾病事件，把含马兜铃酸的关木通和广防己误用为不含马兜铃酸的木通和粉防己；有毒土三七误当三七使用引起肝损害；亚香棒虫草混入冬虫夏草引起头晕、呕吐、心悸等；有剧毒的东莨菪根混入苍术中造成了“苍术造假”事件；洋金花混入凌霄花的中毒事件；含土大黄苷的土大黄误当大黄使用造成制售假药；山银花冒充金银花、桃仁中掺苦杏仁等混伪品问题时有发生（钱忠直等， 2014）。中药材的真伪鉴别直接关系到用药安全以及科学研究的准确性，中药安全性已引起全民关注，成为中药产业化和国际化的主要挑战之一。随着科学研究的不断深入，一种新的中药材鉴定技术应运而生，即 DNA条形码技术，通过为中药材制作一张特殊的基因“身份证”，对物种进行快速、准确的识别与鉴定。
由于不同物种的 DNA序列是由腺嘌呤 （A） 、鸟嘌呤 （G） 、胞嘧啶 （C） 、胸腺嘧啶 （T） 四种碱基以不同顺序排列组成，因此对一定长度的 DNA序列进行分析即能够区分不同物种。 DNA条形码技术是国际上近年来发展起来的生物物种鉴定新技术，已经成为国际上生物分类和物种鉴定研究的热点，是近年来发展最迅速的学科前沿之一。该技术在传统形态分类学对物种准确鉴定的基础上，通过对样品标准序列进行测序，建立 DNA条形码数据库，可实现物种鉴定的标准化。该技术具有以下几大优势：①只需选用一个或少数几个基因片段即可对绝大部分物种进行准确鉴定；②鉴定过程快速，可以在短时间内鉴定大量样本；③重复性和稳定性高；④实验过程标准、操作简单，容易实现物种鉴定自动化；⑤可有效缓解分类鉴定人才缺乏的现状；⑥可通过互联网和信息平台对现有物种序列信息进行集中统一管理，并可实现共享。该方法由于不受环境因素的影响以及样品形态和材料部位的限制，可为中药原植物和中药材的品种鉴别提供准确依据，通过大量实验验证并获得中药鉴定专家的认可。
一、DNA条形码技术发展简史 2003年，加拿大动物学家 Hebert首次提出了 DNA条形码的概念 （Hebert et al.，2003a）。分类专家、
分子生物学家和生物信息学家 2003年 3月在美国冷泉港召开了题为“Taxonomy and DNA”的会议，提出对全球所有生物种的某个特定基因进行大规模测序，以期实现物种鉴定的目标，推进生物进化史研究。 2003年 9月，在冷泉港召开了题为“ Taxonomy，DNA and the Barcode of Life”的学术会议，对 DNA编码所有真核生物的科学性进行了更深入讨论，该会议提出组织策略及国际生物条形编码计划 （International Barcode of Life Project）的发展蓝图。生物学家和鉴定学者随后开展了大量实验以证实条形码在物种鉴定中的可行性。 Hebert等对鳞翅目 （Lepidopterans）昆虫 200个密切相关的种进行 COI基因特定片段分析的结果表明该特定片段可以成功地鉴定每一个物种 （Hebert et al.，2003b）。Yoo等运用 COI作为条形码对韩国 92种鸟类物种进行了有效鉴定 （Yoo et al.，2006） 。同时， COI基因特定片段作为 DNA条形码在真菌的鉴定研究中也取得了有价值的结果。 Min等对 Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota包含的 31个真菌物种 COI序列进行了研究，结果显示约 600 bp的 COI基因片段长度可对上述物种进行准确鉴定 （Min et al.，2007） 。另外， DNA barcoding技术还在蝴蝶类 （Hebert et al.，2004） 、热带鳞翅类 （Hajibabaei et al.，2006） 、澳大利亚鱼类 （Ward et al.，2005）等动物物种表现出较强的鉴定能力。目前 COI序列作为动物物种的通用条形码已经获得生物分类学家的广泛认可。
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